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本试剂盒是先以萤光素(luciferin)为底物来检测萤火虫萤光素酶(Firefly luciferase)，后以肠腔素(coelenterazine)为底物来检测海肾萤光素酶(Renilla luciferase)，并且在后续加入海肾萤光素酶底物时，同时加入抑制萤火虫荧光素酶催化luciferin发光的物质，使后续检测仅仅检测到海肾萤光素酶的活性，实现双萤光素酶报告基因检测。

萤火虫萤光素酶是一种分子量约为61kD的蛋白，在ATP、镁离子和氧气存在的条件下，可以催化luciferin氧化成oxyluciferin，在luciferin氧化的过程中，会发出生物萤(bioluminescence)。海肾萤光素酶是一种分子量约为36kD的蛋白，在氧气存在的条件下，可以催化coelenterazine氧化成coelenteramide，在coelenterazine氧化的过程中也会发出生物萤光。生物萤光可以通过化学发光仪(luminometer)或多功能酶标仪(LUM功能)。

萤火虫萤光素酶催化luciferin发光的最强发光波长为560nm。海肾萤光素酶催化coelenterazine发光的最强发光波长为465nm。

通常将目的基因的5′UTR或者启动子克隆至Firefly Luciferase的上游，或者3′UTR克隆至FireflyLuciferase的下游，通过检测萤火虫荧光素酶的量来检测启动子或者调控元件的转录调控作用。RenillaLuciferase作为内参，来消除细胞数量或者转染效率的差异。

1. 无菌操作。
   
2. 荧光染料操作中注意避光进行。
   
3. 由于温度对酶反应有影响，所以测定时样品和试剂均需达到室温后再进行测定。
   
4. 为保证荧光素酶检测试剂的稳定性，可以采取适当分装后避光保存的方法，以避免反复冻融和长时间暴露于室温。
   
5. 萤火虫荧光素酶检测试剂、Renilla荧光素酶检测试剂最好现用现配。
   
6. 细胞裂解液及裂解时间可根据细胞量适当增加、延长。
   
7. 关于检测仪器的选择：能够检测化学发光或者生物发光的仪器都可适用于此试剂盒。如果使用多功能酶标仪，为防止各孔之间的干扰，我们推荐使用黑色酶标板，并且不同实验组之间最好有间隔。

1. 裂解细胞
   根据不同的细胞培养板加入适量的细胞裂解液：

   多孔板	裂解液
   6孔板	500μL
   12孔板	250μL
   24孔板	100μL
   48孔板	65μL
   96孔板	20μL

   
   
   1. 对于贴壁细胞：吸尽细胞培养液后用1×PBS润洗2遍后加入细胞裂解液，使裂解液完全覆盖细胞；对于悬浮细胞：离心去上清后用1×PBS润洗2遍后离心去上清，加入细胞裂解液。
      
   2. 于振荡器上室温裂解20min以裂解充分。
      注：细胞裂解后可以立即测定荧光素酶，也可以先冻存，待以后再测定。冻存样品需融解，并达到室温后再进行测定。
2. 荧光数值检测(酶标板中操作)
   将样本、萤火虫荧光素酶检测试剂、Renilla荧光素酶检测试剂平衡至室温后再进行以下操作：
   
   1. 取20μL细胞裂解样本，加至黑色酶标板中，按照实验要求，可设置3～5孔重复。
      
   2. 每孔加入100μL萤火虫荧光素酶检测试剂，用移液器轻柔吹打混匀后OD560nm处读数；以不含细胞的细胞裂解液为空白对照，检测尽量在30min内完成。
      
   3. 每孔加入100μL Renilla荧光素酶检测试剂，使用酶标仪震荡混匀后OD465nm处读数。以不含细胞的细胞裂解液为空白对照，检测尽量在30min内完成。
3. 计算荧光比值
   在以Renilla荧光素酶为内参的情况下，用萤火虫荧光素酶测定得到的RLU值除以Renilla荧光素酶测定得到的RLU值。根据得到的比值来比较不同样品间目的报告基因的激活程度。